♦ 研究背景及简介
心理健康风险是载人深空探索和长期封闭环境中最严重、最复杂的风险之一。近年来，随着微生物群-肠-脑轴研究的深入，肠道微生物群被认为是维持和改善心理健康的新途径。然而，肠道微生物群与长期封闭环境中的心理变化之间的相关性仍知之甚少。
2023年4月，北京理工大学的郝梓凯和北京航空航天大学的刘红合作在《Microbiome》期刊发表了一项基于“月宫365”的多组学研究，主要研究长期封闭环境下，肠道菌群与机组成员心理健康之间的关系。研究结果确定了四种潜在的精神益生菌（Bacteroides uniformis，Roseburia inulinivorans，Eubacterium rectale和Faecalibacterium prausnitzii）。
在宏基因组学、宏蛋白质组学和代谢组学分析的基础上，四种潜在的精神益生菌主要通过与神经系统功能相关的三个途径改善情绪：产生丙酸和丁酸等短链脂肪酸途径，调节氨基酸代谢途径和其他调节牛磺酸、皮质醇代谢途径。此外，通过对模拟慢性压力引起的抑郁和焦虑大鼠实验验证，功能机制获得了进一步支持。
♦ 研究样本
（1）该实验共有8名机组成员，共收集了103份心理数据和相应的粪便样本。
（2）组学方法：103份、90份和56份粪便样本分别进行了宏基因组、宏蛋白质组和代谢组学分析。
（3）图1是“月宫一号”的结构和实验流程。“月宫365”实验是在LP1中进行的，它包括两个植物舱室和一个综合舱室。
图1.“月宫一号”的结构和实验流程
♦ 研究结果
◊ 鉴定潜在的精神益生菌
为了确定潜在的精神益生菌，研究者测量并记录了收集粪便当天机组人员的情绪，发现优势门是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，占样本的75%以上。发现A、B、C机组人员的主要微生物属为Prevotella。在D-H机组人员中，Bacteroides是数量最多的属。
PCA分析结果显示，肠道微生物群的组成和心理变化在个体和性别之间分别存在显著差异（P < 0.001）。心理数据分析结果显示机组人员的心理变化随时间呈动态变化，每个机组人员的心理变化具有明显的个体差异和性别差异。结果表明Bacteroides uniformis，Eubacterium rectale，Eubacterium rectale CAG:36，Roseburia inulinivorans，Roseburia inulinivorans CAG15和Faecalibacterium prausnitzii这些菌群与积极情绪的变化呈显著正相关(P < 0.05)，与消极情绪的演变呈负相关(P < 0.05)。因此，这些菌株被进一步分析为潜在的精神益生菌。
研究人员还采用了自相关函数（ACF）来测试潜在精神益生菌时间序列的平稳性。结果表明，潜在精神益生菌随时间的变化也是一个静态随机过程。也就是说，肠道微生物群和情绪随时间的变化无显著自相关。因此，研究肠道微生物群与心理变化之间的关系就足够了。
图2. 鉴定潜在的精神益生菌。（a）门的丰度随时间变化的百分比堆叠图。（b）前10个属相对丰度直方图。（c）分别基于个体和性别差异下肠道微生物群相对丰度的主成分分析(PCA)评分图。（d）心理因素得分随时间变化的水平图。由以每个心理因素时间序列为中心的中位数构建的。曲线被划分为色带，其宽度为中值绝对偏差。较冷和较暖的区域分别表示某个因素超过和低于其中位数得分的日期范围。颜色越深，因子得分的绝对值越高。（e）潜在精神益生菌与心理因子得分的Spearman相关性热图。在50%以上的心理因素中，相关系数R≥0.5 (P≤0.001)的潜在心理生成物显示在这里。相关系数的缩放用颜色深度表示——正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001。
◊ 潜在精神益生菌的宏基因组功能分析
为了评估肠道微生物功能，使用KEGG数据库对103个宏基因组样本进行了注释。结果显示，机组人员肠道菌群的KO功能组成在个体和性别之间也存在显著差异（P< 0.001）。
选取50%以上心理因素VIP评分≥1的KO作为关键KO进行Spearman相关分析，发现40个KOs与积极情绪呈显著正相关（P＜0.05），与消极情绪呈显著负相关（P＜0.05）。这40个KOs中涉及34种酶，其中18种酶参与微生物发酵产生短链脂肪酸(SCFAs)。
这些KOs涉及以下途径：丙酮酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）、脂肪酸生物合成、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、糖酵解/糖异生、乙醛酸和二羧酸代谢、甲烷代谢、氧化磷酸化、泛酸和CoA生物合成、戊糖-磷酸盐途径、丙酸代谢、丁酸代谢、嘌呤代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成。
图3. 潜在精神益生菌的宏基因组功能分析。（a）KEGG数据库中关键的同源群(ortholog groups)与心理因子得分的Spearman相关性热图。此处显示的是与50%以上的心理因素相关系数R≥0.5 (P＜0.001)的KOs。相关系数的缩放用颜色深度表示——正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。（b）利用鉴定的KOs构建SCFA生成代谢途径。（c）使用iPATH3 分析（a）中涉及的40个通路。这些通路与积极情绪呈正相关，与消极情绪负相关。
◊ 潜在精神益生菌的宏蛋白质组学功能分析
值得注意的是，当宏基因组学分析预测的功能不一定表达时，可以使用其他组学来分析微生物表达的功能。因此，作者又进行了宏蛋白质组学的研究，从90个粪便样本中鉴定出5324个蛋白质。根据PCA和MANOVA分析结果显示，研究对象的肠道微生物群的宏蛋白质组学特征，在个体和性别之间存在显著差异（P<0.001）。
选择50%以上心理因素VIP评分≥1的蛋白质组作为Spearman相关分析的关键蛋白质组。结果表明，23个蛋白质组与积极情绪呈显着正相关（P<0.05），与消极情绪呈显着负相关（P<0.05）。对这23个蛋白质组进行KEGG功能富集分析。
结果显示这23个蛋白质组参与了67个KEGG通路。另外对23个蛋白质序列进行KO注释和分类群-功能耦合分析。最终得到18个KO，并且这些 KEGG 通路与相应的潜在精神益生菌相匹配。
图4. 潜在精神益生菌的宏蛋白质组功能分析。（a）关键蛋白质组和心理因素得分的相关性热图。图中显示了与50%以上的心理因素相关系数R≥0.35（P＜0.001）的蛋白质组。相关系数的缩放用颜色深度表示——正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001。（b）基于关键蛋白质组的KEGG功能富集分析(P-adjusted = 0.05)。（c）关键蛋白质组的分类群功能耦合富集分析。
◊ 潜在精神益生菌的代谢组学分析
本研究收集56份粪便样本进行非靶向代谢组学分析。结果显示，粪便代谢物的组成在个体和性别之间存在显著差异（P<0.001）。
通过文献分析，从这些关键代谢物中鉴定出 21种与神经系统相关的代谢物，用于Spearman 相关性分析。与潜在精神益生菌变化显著相关的代谢物（P<0.05）主要参与葡萄糖脱羧生成γ-氨基丁酸（GABA）和色氨酸代谢途径。
此外，在色氨酸代谢途径中，色胺、血清素和犬尿酸（KYNA）与益生菌的相对丰度呈显著正相关；然而，5-羟基吲哚-3-乙酸 (5-HIAA) 和吡啶甲酸与益生菌的相对丰度呈显著负相关。
在谷氨酸脱羧生成GABA的途径中，GABA与益生菌相对丰度显著正相关，谷氨酸与益生菌相对丰度显著负相关。
图5. 潜在精神益生菌的代谢组学分析。（a）关键代谢物和潜在精神益生菌的相关性热图。相关系数的缩放用颜色深度表示——正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。（b）与葡萄糖脱羧为γ -氨基丁酸(GABA)和色氨酸代谢相关的途径，以已确定的代谢物为代表，与潜在的精神生物显著相关。“+”与潜在精神益生菌相对丰度的变化呈显著正相关，“-”与潜在精神益生菌相对丰度的变化呈显著负相关。
◊ 潜在精神益生菌对 CUMS 诱导的大鼠焦虑样和抑郁样行为的影响
为了确定潜在的精神益生菌对宿主情绪的影响，分别将Bacteroides uniformis，Roseburia inulinivorans，Eubacterium rectale和Faecalibacterium prausnitzii 接种到CUMS诱导的抑郁和焦虑样大鼠中。在之前的动物实验中，作者发现F. prausnitzii对CUMS诱导的抑郁和焦虑样行为具有预防和治疗作用。
在本研究中，行为测试显示：与对照组大鼠（CTL 组）相比，CUMS 处理的大鼠（CUMS 组）进入中心区域的频率显著降低（P<0.05）。在高架迷宫试验（EPMT）中，盐酸氟西汀（Flx）和B. uniformis（BU）治疗的大鼠在中心区域花费的时间显著增加（P < 0.05）；B. uniformis、R. inulinivorans（RI）和E. rectale（ER）处理的大鼠，进入张开臂的频率显著增加（P < 0.05）或进入张开双臂的时间显著增加（P < 0.05）；盐酸氟西汀、B. uniformis、R. inulinivorans（RI）和E. rectale（ER）处理的大鼠的静止时间显著减少（P < 0.05）。
这些结果表明，氟西汀和潜在的精神药物治疗可显著减少CUMS诱导的大鼠抑郁和焦虑样行为。
图6. 潜在的精神益生菌对慢性不可预测的轻度应激(CUMS)诱导的大鼠焦虑样和抑郁样行为的影响。（a）大鼠治疗及实验过程。（b）各组大鼠行为测试结果。EPMT和OFT评估焦虑样行为，FST评估抑郁样行为。（c）短链脂肪酸(SCFAs)的测定结果。（d）神经递质测量结果。（e）生化测定结果。数值以单数据点叠加于箱形图的形式表示，箱形图以均数±标准误差(SE)表示。采用Duncan检验的单因素方差分析评估组间差异。* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001。
♦ 文章小结
本研究分析了“月宫365”实验中8名机组人员粪便样本的多组学数据，确定了4种潜在的精神益生菌（Bacteroides uniformis，Roseburia inulinivorans，Eubacterium rectale和Faecalibacterium prausnitzii），确定了这些潜在的精神益生菌对情绪的作用的三个途径，并通过动物实验验证了这些潜在的心理生物制剂对情绪的影响及其机制。
此外，还发现了这些潜在的精神益生菌改善情绪的其他机制，如产生其他小分子代谢物（如组胺、L-谷氨酰胺和盐酸去甲肾上腺素），并减少由CUMS引起的肠道通透性和炎症反应的增加，从而通过影响肠神经系统（ENS）和中枢神经系统（CNS）来改善情绪。
该研究结果为未来开发基于微生物群的缓解负面情绪对策提供了基础，可以在未来人类在月球或火星的长期太空探险中，减轻机组人员心理健康的风险。
同时，也为心理生物学在神经精神治疗中的应用提供了重要的参考。也可以考虑如何在食品中添加这些“精神益生菌”，通过肠道菌群调节来调节情绪。
图7. 主要研究结果的图表总结
♦ 研究背景及简介
心理健康风险是载人深空探索和长期封闭环境中最严重、最复杂的风险之一。近年来，随着微生物群-肠-脑轴研究的深入，肠道微生物群被认为是维持和改善心理健康的新途径。然而，肠道微生物群与长期封闭环境中的心理变化之间的相关性仍知之甚少。
2023年4月，北京理工大学的郝梓凯和北京航空航天大学的刘红合作在《Microbiome》期刊发表了一项基于“月宫365”的多组学研究，主要研究长期封闭环境下，肠道菌群与机组成员心理健康之间的关系。研究结果确定了四种潜在的精神益生菌（Bacteroides uniformis，Roseburia inulinivorans，Eubacterium rectale和Faecalibacterium prausnitzii）。
在宏基因组学、宏蛋白质组学和代谢组学分析的基础上，四种潜在的精神益生菌主要通过与神经系统功能相关的三个途径改善情绪：产生丙酸和丁酸等短链脂肪酸途径，调节氨基酸代谢途径和其他调节牛磺酸、皮质醇代谢途径。此外，通过对模拟慢性压力引起的抑郁和焦虑大鼠实验验证，功能机制获得了进一步支持。
♦ 研究样本
（1）该实验共有8名机组成员，共收集了103份心理数据和相应的粪便样本。
（2）组学方法：103份、90份和56份粪便样本分别进行了宏基因组、宏蛋白质组和代谢组学分析。
（3）图1是“月宫一号”的结构和实验流程。“月宫365”实验是在LP1中进行的，它包括两个植物舱室和一个综合舱室。
图1.“月宫一号”的结构和实验流程
♦ 研究结果
◊ 鉴定潜在的精神益生菌
为了确定潜在的精神益生菌，研究者测量并记录了收集粪便当天机组人员的情绪，发现优势门是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，占样本的75%以上。发现A、B、C机组人员的主要微生物属为Prevotella。在D-H机组人员中，Bacteroides是数量最多的属。
PCA分析结果显示，肠道微生物群的组成和心理变化在个体和性别之间分别存在显著差异（P < 0.001）。心理数据分析结果显示机组人员的心理变化随时间呈动态变化，每个机组人员的心理变化具有明显的个体差异和性别差异。结果表明Bacteroides uniformis，Eubacterium rectale，Eubacterium rectale CAG:36，Roseburia inulinivorans，Roseburia inulinivorans CAG15和Faecalibacterium prausnitzii这些菌群与积极情绪的变化呈显著正相关(P < 0.05)，与消极情绪的演变呈负相关(P < 0.05)。因此，这些菌株被进一步分析为潜在的精神益生菌。
研究人员还采用了自相关函数（ACF）来测试潜在精神益生菌时间序列的平稳性。结果表明，潜在精神益生菌随时间的变化也是一个静态随机过程。也就是说，肠道微生物群和情绪随时间的变化无显著自相关。因此，研究肠道微生物群与心理变化之间的关系就足够了。
图2. 鉴定潜在的精神益生菌。（a）门的丰度随时间变化的百分比堆叠图。（b）前10个属相对丰度直方图。（c）分别基于个体和性别差异下肠道微生物群相对丰度的主成分分析(PCA)评分图。（d）心理因素得分随时间变化的水平图。由以每个心理因素时间序列为中心的中位数构建的。曲线被划分为色带，其宽度为中值绝对偏差。较冷和较暖的区域分别表示某个因素超过和低于其中位数得分的日期范围。颜色越深，因子得分的绝对值越高。（e）潜在精神益生菌与心理因子得分的Spearman相关性热图。在50%以上的心理因素中，相关系数R≥0.5 (P≤0.001)的潜在心理生成物显示在这里。相关系数的缩放用颜色深度表示——正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001。
◊ 潜在精神益生菌的宏基因组功能分析
为了评估肠道微生物功能，使用KEGG数据库对103个宏基因组样本进行了注释。结果显示，机组人员肠道菌群的KO功能组成在个体和性别之间也存在显著差异（P< 0.001）。
选取50%以上心理因素VIP评分≥1的KO作为关键KO进行Spearman相关分析，发现40个KOs与积极情绪呈显著正相关（P＜0.05），与消极情绪呈显著负相关（P＜0.05）。这40个KOs中涉及34种酶，其中18种酶参与微生物发酵产生短链脂肪酸(SCFAs)。
这些KOs涉及以下途径：丙酮酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）、脂肪酸生物合成、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、糖酵解/糖异生、乙醛酸和二羧酸代谢、甲烷代谢、氧化磷酸化、泛酸和CoA生物合成、戊糖-磷酸盐途径、丙酸代谢、丁酸代谢、嘌呤代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成。
图3. 潜在精神益生菌的宏基因组功能分析。（a）KEGG数据库中关键的同源群(ortholog groups)与心理因子得分的Spearman相关性热图。此处显示的是与50%以上的心理因素相关系数R≥0.5 (P＜0.001)的KOs。相关系数的缩放用颜色深度表示——正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。（b）利用鉴定的KOs构建SCFA生成代谢途径。（c）使用iPATH3 分析（a）中涉及的40个通路。这些通路与积极情绪呈正相关，与消极情绪负相关。
◊ 潜在精神益生菌的宏蛋白质组学功能分析
值得注意的是，当宏基因组学分析预测的功能不一定表达时，可以使用其他组学来分析微生物表达的功能。因此，作者又进行了宏蛋白质组学的研究，从90个粪便样本中鉴定出5324个蛋白质。根据PCA和MANOVA分析结果显示，研究对象的肠道微生物群的宏蛋白质组学特征，在个体和性别之间存在显著差异（P<0.001）。
选择50%以上心理因素VIP评分≥1的蛋白质组作为Spearman相关分析的关键蛋白质组。结果表明，23个蛋白质组与积极情绪呈显着正相关（P<0.05），与消极情绪呈显着负相关（P<0.05）。对这23个蛋白质组进行KEGG功能富集分析。
结果显示这23个蛋白质组参与了67个KEGG通路。另外对23个蛋白质序列进行KO注释和分类群-功能耦合分析。最终得到18个KO，并且这些 KEGG 通路与相应的潜在精神益生菌相匹配。
图4. 潜在精神益生菌的宏蛋白质组功能分析。（a）关键蛋白质组和心理因素得分的相关性热图。图中显示了与50%以上的心理因素相关系数R≥0.35（P＜0.001）的蛋白质组。相关系数的缩放用颜色深度表示——正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001。（b）基于关键蛋白质组的KEGG功能富集分析(P-adjusted = 0.05)。（c）关键蛋白质组的分类群功能耦合富集分析。
◊ 潜在精神益生菌的代谢组学分析
本研究收集56份粪便样本进行非靶向代谢组学分析。结果显示，粪便代谢物的组成在个体和性别之间存在显著差异（P<0.001）。
通过文献分析，从这些关键代谢物中鉴定出 21种与神经系统相关的代谢物，用于Spearman 相关性分析。与潜在精神益生菌变化显著相关的代谢物（P<0.05）主要参与葡萄糖脱羧生成γ-氨基丁酸（GABA）和色氨酸代谢途径。
此外，在色氨酸代谢途径中，色胺、血清素和犬尿酸（KYNA）与益生菌的相对丰度呈显著正相关；然而，5-羟基吲哚-3-乙酸 (5-HIAA) 和吡啶甲酸与益生菌的相对丰度呈显著负相关。
在谷氨酸脱羧生成GABA的途径中，GABA与益生菌相对丰度显著正相关，谷氨酸与益生菌相对丰度显著负相关。
图5. 潜在精神益生菌的代谢组学分析。（a）关键代谢物和潜在精神益生菌的相关性热图。相关系数的缩放用颜色深度表示——正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。（b）与葡萄糖脱羧为γ -氨基丁酸(GABA)和色氨酸代谢相关的途径，以已确定的代谢物为代表，与潜在的精神生物显著相关。“+”与潜在精神益生菌相对丰度的变化呈显著正相关，“-”与潜在精神益生菌相对丰度的变化呈显著负相关。
◊ 潜在精神益生菌对 CUMS 诱导的大鼠焦虑样和抑郁样行为的影响
为了确定潜在的精神益生菌对宿主情绪的影响，分别将Bacteroides uniformis，Roseburia inulinivorans，Eubacterium rectale和Faecalibacterium prausnitzii 接种到CUMS诱导的抑郁和焦虑样大鼠中。在之前的动物实验中，作者发现F. prausnitzii对CUMS诱导的抑郁和焦虑样行为具有预防和治疗作用。
在本研究中，行为测试显示：与对照组大鼠（CTL 组）相比，CUMS 处理的大鼠（CUMS 组）进入中心区域的频率显著降低（P<0.05）。在高架迷宫试验（EPMT）中，盐酸氟西汀（Flx）和B. uniformis（BU）治疗的大鼠在中心区域花费的时间显著增加（P < 0.05）；B. uniformis、R. inulinivorans（RI）和E. rectale（ER）处理的大鼠，进入张开臂的频率显著增加（P < 0.05）或进入张开双臂的时间显著增加（P < 0.05）；盐酸氟西汀、B. uniformis、R. inulinivorans（RI）和E. rectale（ER）处理的大鼠的静止时间显著减少（P < 0.05）。
这些结果表明，氟西汀和潜在的精神药物治疗可显著减少CUMS诱导的大鼠抑郁和焦虑样行为。
图6. 潜在的精神益生菌对慢性不可预测的轻度应激(CUMS)诱导的大鼠焦虑样和抑郁样行为的影响。（a）大鼠治疗及实验过程。（b）各组大鼠行为测试结果。EPMT和OFT评估焦虑样行为，FST评估抑郁样行为。（c）短链脂肪酸(SCFAs)的测定结果。（d）神经递质测量结果。（e）生化测定结果。数值以单数据点叠加于箱形图的形式表示，箱形图以均数±标准误差(SE)表示。采用Duncan检验的单因素方差分析评估组间差异。* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001。
♦ 文章小结
本研究分析了“月宫365”实验中8名机组人员粪便样本的多组学数据，确定了4种潜在的精神益生菌（Bacteroides uniformis，Roseburia inulinivorans，Eubacterium rectale和Faecalibacterium prausnitzii），确定了这些潜在的精神益生菌对情绪的作用的三个途径，并通过动物实验验证了这些潜在的心理生物制剂对情绪的影响及其机制。
此外，还发现了这些潜在的精神益生菌改善情绪的其他机制，如产生其他小分子代谢物（如组胺、L-谷氨酰胺和盐酸去甲肾上腺素），并减少由CUMS引起的肠道通透性和炎症反应的增加，从而通过影响肠神经系统（ENS）和中枢神经系统（CNS）来改善情绪。
该研究结果为未来开发基于微生物群的缓解负面情绪对策提供了基础，可以在未来人类在月球或火星的长期太空探险中，减轻机组人员心理健康的风险。
同时，也为心理生物学在神经精神治疗中的应用提供了重要的参考。也可以考虑如何在食品中添加这些“精神益生菌”，通过肠道菌群调节来调节情绪。
图7. 主要研究结果的图表总结
