Nat Methods｜DIP-MS：用于解构蛋白复合物的超深度相互作用蛋白质组学

蛋白质通常以大分子组装体的形式存在，这些组装体对调控和催化大多数细胞过程至关重要。然而，传统的亲和纯化结合液相色谱-串联质谱（AP–MS）方法不能在单个实验中解决复杂的异构体组成问题，需要从多个时间和资源密集型的反复AP–MS实验中进行计算推断。

为了解决这一问题，苏黎世联邦理工学院分子系统生物学研究所的 Matthias Gstaiger 团队引入了一种称为 “深度交互分析质谱（deep interactome profiling by mass spectrometry，DIP-MS）” 的新方法，结合了AP和BN-PAGE*分离（blue-native-PAGE separation）、数据非依赖性采集和深度学习信号处理。
* BN-PAGE：Blue Native PAGE，Hermann Schägger 等人于1991年建立的蛋白电泳技术，用于从生物样品（质膜、胞浆等）中分离蛋白质复合物。

3月26日，该研究以DIP-MS: ultra-deep interaction proteomics for the deconvolution of protein complexes为题发表在Nature Methods（IF：48）上。

图1 论文截图

研究人员将DIP-MS用于对蛋白质复合物进行深入的相互作用蛋白质组学分析，以解析复合物的组成。文章通过质谱技术和结构预测揭示了细胞中新的蛋白折叠底物与PAQosome和PFD（prefoldin）复合物的相互作用网络，拓展了对细胞蛋白质折叠调控机制的认识。

DIP-MS方法流程概述

首先，通过亲和纯化将含有诱饵蛋白（bait protein）的蛋白质复合物富集，然后使用BN-PAGE将复合物按照表观分子量进行分离。

接下来，将凝胶切割成大约70个1mm宽的片段，然后使用96孔板格式的快速、可重复的filter aided in-gel消化制备方案对每个片段进行处理。

最后，使用短液相色谱梯度结合定量DIA-MS测量每个分数的蛋白质肽段。通过PPIprophet处理肽片段离子谱的共迁移矩阵来推断定量蛋白电泳洗脱模式、组装状态和PPIs。对显示多个峰的蛋白质轮廓进行进一步解卷积，从而在单个DIP-MS实验中鉴定包含诱饵蛋白的多个复合物。

图2 DIP-MS工作流程

结果1：
用于PPI预测和复杂推理的深度学习框架

PPIprophet是基于数据驱动神经网络的蛋白质复合物解卷积系统，可从DIP-MS数据中提取PPI、诱饵蛋白复合物的识别、亚单位数量和分子量的推断以及通常在AP-MS中看不到的prey–prey interactions。

研究人员开发了一个深度神经网络（DNN）模型用于PPI预测，并使用超过150万个从不同类型的共迁移测量中提取的PPIs进行训练。研究人员比较了PPIprophet与其他共迁工具的性能，并证明了其在DIP-MS数据集分析中的优越性。

结果2：
DIP-MS与AP-MS和SEC-MS工作流程的基准测试

研究人员比较了使用PFDN2作为诱饵蛋白的DIP-MS结果与两种正交方法生成的数据：SEC-MS和使用11个PFD-PFDL亚基作为诱饵的反向AP-MS数据集。

结果表明，DIP-MS数据共鉴定了353个相互作用伙伴，比SEC-MS和AP-MS多出187个，覆盖了大约30%的公共数据库中的相互作用伙伴。

研究人员进一步分析了DIP-MS与SEC-MS或AP-MS数据的拓扑结构和网络连通性，并发现DIP-MS生成的网络更加广泛、密集，并且重现了更多的真实情况。

结果3：
Prefoldin和prefoldin-like复合物的全局结构

研究人员使用DIP-MS分析了PFDN2和PFDL（prefoldin-like）中的UXT，并得到了详细的prefoldin和prefoldin-like复合物谱图。在两个DIP-MS实验中，研究人员总共分析了1513个蛋白质，检测到了6762（PFDN2）和5682（UXT）个高置信度二元相互作用，得到了包含11552个唯一相互作用和939个蛋白质的网络。

在组合DIP-MS衍生网络中，研究人员识别了所有已报告的PFD–PFDL组装，包括PFD、PFDL和包含PAQosome的PFDL。此外，他们还识别了由R2TP蛋白RUVBL1/2、RPAP3和PIH1D1以及CCT/TRiC-PFD复合物的所有亚基组成的共迁移组。

图3 从PFDN2和UXT DIP-MS实验中鉴定组装

结果4：
发现含PDRG1的另一种PFD复合物

研究人员发现了一个新的PFD复合物亚型，命名为PFD homolog（PFDh），其中包含了PDRG1。

通过DIP-MS实验和结构预测，研究人员确定了PDRG1与经典PFD亚基形成的复合物。进一步的验证表明，PDRG1与经典PFD亚基发生交互作用，并构成了PFD复合物的一个变体。结构预测显示PFDh与经典PFD有相似的结构，但PDRG1的存在可能影响其底物的特异性。该研究的发现揭示了PFD复合物的多样性，未来需要进一步研究PFDh的分子功能。

结果5：
PAQosome和PFDL核心成分的鉴定

通过DIP-MS和AP-MS方法，研究人员确定了PAQosome和PFDL的核心组分。他们发现了ASDURF作为PFDL的亚基，同时也是PAQosome超级复合物的成分之一。

此外，研究还揭示了POLR2E与PFDL复合物之间的PPI，表明POLR2E是PFDL复合物的核心组分之一，这与目前文献中关于PFDL复合物的六聚体范式（hexameric paradigm）存在偏差，并提出了一个更新的包含POLR2E的异质性七聚体PFDL复合物的假设。

结果6：
通过DIP-MS鉴定了经典PFD折叠客户

利用DIP-MS技术的高灵敏度，研究人员识别了与PFD和CCT/TRiC复合物相互作用的新型折叠客户（folding clients）。

通过从PPIprophet派生的PPI网络（10％FDR阈值）中选择与CCT/TRiC和PFD或PAQosome相互作用的蛋白质亚网络，识别了这些亚网络中的复合物-复合物相互作用以及蛋白质-复合物相互作用。

结果7：
鉴定PAQosome的客户复合物及客户

利用DIP-MS技术，研究人员鉴定了完全组装的PAQosome辅助伴侣的客户复合物（client complexes）和客户蛋白（client proteins）。PAQosome是一个大型多蛋白质组装体，协助HSP90组装蛋白复合物（如snRNPs、RNAP复合物和snoRNP组装体）。

研究人员发现了45个已知clients以及许多其他潜在clients，并通过共沉积和AP-MS数据验证了这些发现。此外，还发现了新的潜在客户复合物和客户蛋白，揭示了DIP-MS在解剖特定相互作用网络方面的分辨率和有效性。