2024年2月1日，丹麦哥本哈根大学诺和诺德基金会蛋白质研究中心的Jesper V. Olsen和赛默飞世尔科技质谱研发团队合作在 Nature Biotechnology （IF=46.9）上发表了新的文章：Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition。
图1 论文截图
文章介绍了一种在Orbitrap Astral质谱上实现的名为“narrow-window data-independent acquisition （nDIA）”（窄窗口式数据非依赖性采集）的质谱技术，旨在实现在快速、可重复的情况下对全面蛋白质组进行定量分析。
结论1：
Orbitrap Astral 质谱仪模糊了DIA和DDA之间的界限
研究人员介绍了窄窗口式数据非依赖采集（nDIA）策略，包括高分辨率 MS1 扫描和使用 2-Th 隔离窗的约200 Hz并行串联质谱（MS/MS）扫描，可消除DDA和DIA方法之间的差异。这一目标是这是通过将四极杆 Orbitrap 质谱仪与非对称轨道无损质量分析器Astral配对实现的。该技术允许在较短的液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析时间内进行高通量、深度蛋白质组覆盖和准确定量。
作者详细描述了Astral质谱仪的结构和工作原理，以及在人胚胎肾细胞（HEK293）的消化产物中，通过nDIA模式获得了更高的蛋白质前体和蛋白质组的鉴定数量。研究还介绍了对质谱仪性能的评估，包括伪发现率（FDR）的估计和质谱精度的测定，最终得出Astral质谱仪在MS/MS模式下取得了令人满意的结果。
图2 nDIA 与 DDA 的基准测试 a:Orbitrap Astral 质谱仪硬件概览
结论2：
快速测序实现深度蛋白质组分析
通过使用Orbitrap Astral质谱仪，研究人员展示了在不同条件下对酵母和人类细胞蛋白质组进行全面覆盖的能力。在酵母细胞的分析中，采用新的窄窗口式数据非依赖采集（nDIA）方法，成功实现了对约4,500种蛋白质的快速、高效分析，实现了近乎完整的酵母蛋白质组覆盖，比之前的研究速度提高了10倍。
在对人胚胎肾细胞（HEK293）的不同负荷和梯度长度的试验中，nDIA可实现对人蛋白质组的高通量、高灵敏度和高定量再现性的分析。通过优化不同样品负载和LC梯度长度，实现了对多达9,619个蛋白质的高度可重复的鉴定。
研究人员还通过对HeLa细胞的稀释系列和单个细胞的分析，展示了Orbitrap Astral质谱仪在低样品输入下的高灵敏性，能够鉴定出50pg至单个HeLa细胞中的蛋白质。实验结果表明表明 Orbitrap Astral 质谱仪仪器特别适合单细胞蛋白质组学研究。与其他质谱平台相比，Orbitrap Astral质谱仪表现出更高的蛋白质组鉴定数量和更多的修饰肽变体：使用该质谱仪进行的nDIA分析在5分钟梯度下可重复鉴定出超过75,000个不同的修饰肽变体。
结论3：
nDIA技术实现精准的无标记定量技术
通过对包含人类、酵母和大肠杆菌蛋白的混合物进行不同比例的混合，并使用nDIA进行分析，研究人员评估了Orbitrap Astral质谱仪在定量准确性和精度方面的性能。
在28分钟的LC梯度下，使用Orbitrap Astral 质谱仪分析800ng HEK293细胞裂解液，与使用Orbitrap Exploris 480 MS进行45分钟LC梯度的分析相比，Orbitrap Astral MS鉴定了超过2倍的蛋白质和3.5倍的肽前体。Orbitrap Astral 质谱仪表现出较高的可重复性，90%左右的蛋白质CV（变异系数）<20%，并且技术三次重复中缺失值的数量很少（~3%）。
Astral质量分析器的MS/MS定量结果在酵母和大肠杆菌的预期比例下显示出更高的准确性和较低的标准差。同时，更高的蛋白质和肽覆盖量提高了蛋白质定量的性能，尤其是在使用MaxLFQ算法时。与QUANT2.0算法相比，MaxLFQ算法利用了99%以上的测得的前体物质进行蛋白质定量，改进了定量性能。
图3 Orbitrap Astral质谱仪增强LFQ的精度
结论4：
通过快速多次测量策略实现深度蛋白质组获取
为了克服人类蛋白质丰度的固有宽动态范围，研究人员采用了基于离线肽段分离的多次测量蛋白质组学策略，以提高动态范围和覆盖范围。
研究人员利用高分辨率的离线HpH反相色谱结合短在线LC梯度和在Orbitrap Astral质谱仪上进行的nDIA（2 Th）分析，实现了对HEK293细胞裂解液的深度蛋白质组学的全面覆盖。
通过将HEK293细胞裂解液分成46、34、23或12个HpH分馏物，研究人员鉴定了12179个蛋白质和222389个肽序列。与以前的方法相比，这种方法将所需的质谱采集时间减少了六倍，样品投入减少了五倍。
研究结果显示，不同分数方案之间的定量性能在不同分数方案之间具有很高的重现性，其皮尔逊相关系数均在0.9以上。在23 HpH分馏分析的HeLa和HEK细胞中，约90%的蛋白质CV<10%。
通过组合每个分数方案的三个生物学重复，研究人员实现了来自34和46个分馏物的12,328个蛋白质的最大覆盖面。34和46个分馏物方案的蛋白质覆盖率分别为99.4%和96.7%，证明了每天进行多达八个全面的人类蛋白组学分析的可行性。
多次测量方案相对于单次测量具有相似的蛋白质组覆盖度，且这些额外鉴定的蛋白质主要位于低丰度范围，包括重要的信号蛋白。这种多次测量策略为快速、全面地获取多个人类蛋白质组数据提供了可行性，丰富了蛋白质组的深度信息。
图4 通过multi-shot蛋白质组学全面研究人类蛋白质组
结论5：
nDIA技术可助力系统生物学和临床蛋白质组学发展
nDIA技术在系统生物学和临床蛋白质组学方面具有强大的应用潜力。在功能基因组学筛查中，该技术可用于通过基因敲除或基因沉默等手段评估基因功能。
研究中使用5分钟梯度的nDIA方法对包含104个基因敲除的酵母菌株库进行了深入分析，涉及细胞周期、蛋白酶体、DNA损伤应答和激酶基因。通过该技术，研究人员能够在所有生物条件和重复实验中一致定量约4500种蛋白质，其中93.98%的蛋白质的变异系数（CV）小于10%。该技术在约41.5小时内深度分析了每个菌株的蛋白质组，一致重现了最近系统性酵母基因敲除筛查的研究结果。
此外，nDIA还可用于高通量分析大型临床队列和进行生物标记物发现实验。以多系统萎缩（MSA）患者和对照组的人类脑部蛋白质样本为例，使用180-SPD方法分析了45个MSA病例和29个对照的三次技术复制样本；以及40-SPD方法分析了30分钟的活性LC梯度。
结果显示，nDIA分析以超过20倍的速度实现了MSA蛋白质组的全面表征，比原始研究快5倍。与40-SPD方法相比，180-SPD方法在至少70%的样本中更快地确定了60%的蛋白质，并且在至少70%的样本中获得了90%更多的蛋白质。这些结果展示了nDIA在分析大型临床队列和进行生物标志物发现实验中的高通量潜力。
图5 通过全面的酵母蛋白质组分析进行功能基因组学筛选
总 结
总的来说，nDIA技术提出了一种新颖的质谱策略，通过结合高分辨率MS1扫描和高速MS/MS扫描，以及Astral分析器的使用，可实现短时间内对全面蛋白质组的高通量分析。
使用nDIA 策略，每天可分析>100个完整的酵母蛋白质组；或每天分析48个人类蛋白质组，半小时内可分析约10,000个人类蛋白质组；或者在5分钟内对约7,000个蛋白质进行分析，相比当前先进的质谱技术，覆盖范围提高了3倍。
文章也指出，nDIA方法目前的实施方式存在一个局限性，即对总体灵敏度的影响（会相应地降低灵敏度）。尽管文中也提到了可能的解决方法，但仍然存在提高灵敏度的挑战。文章还讨论了该技术的潜在应用领域，包括系统生物学研究和大规模临床队列研究。
专家点评
中国医学科学院苏州系统医学研究所 叶子璐研究员：
利用Orbitrap Astral质谱仪先进的软硬件平台，我们开发了窄窗口数据非依赖采集技术（nDIA）。
该技术在以下两个方面实现了显著的创新：首先，融合了数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）两种主流蛋白质组学采集方式的优点，有效地桥接了DDA与DIA之间的鸿沟，实现了对肽段的系统性和针对性选择，以便在最高效的质量范围内进行鉴定和定量。其次，该技术极大地推动了蛋白质组学进入超高通量分析的新时代。与传统方法相比，nDIA在不同样本之间均实现了约5-10倍的鉴定速度提升，同时在定量精度（precision）和准确度（accuracy）方面也有显著提高。
正如《自然生物技术》上的同期评论所指出的，这项技术对蛋白质组学领域产生了颠覆性的影响（shakes up the proteomics field）。
文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-023-02099-7
